G - 四链体 DNA（G4 DNA）在 DNA 复制调控、表观遗传修饰、免疫炎症应答、肿瘤发生发展及神经退行性疾病进展等生理与病理过程中发挥关键调控作用。精准检测并量化生命体系内 G4 DNA 的丰度，对于阐明上述生理病理机制、挖掘疾病诊疗靶点具有重要的理论与实践意义。

尽管近年来G4 DNA探针相关研究已有诸多报道，但该领域仍面临多重关键挑战：其一，探针分子的理性设计难度较高，致使适用于生命体系原位检测的探针种类稀缺；其二，多数探针依赖单光子激发模式，受激发光穿透深度的固有局限，难以满足深层组织成像的应用需求；其三，部分探针易诱导活性氧（ROS）生成，可能干扰细胞正常生理活动；其四，已报道探针多具有较大的共轭平面结构，存在诱导G4 DNA形成或增强其稳定性的潜在风险，进而导致检测假阳性结果；其五，现有探针缺乏序列特异性识别能力，无法实现不同类型G4 DNA的精准区分。针对上述问题，中山大学巢晖/陈禹教授团队设计并合成了一例双核铱(III)线粒体靶向G4 DNA探针（Ir₂PDP）。该探针可在不干扰线粒体G4 DNA（mitoG4 DNA）固有结构的前提下，结合磷光寿命成像技术，成功实现了细胞及活体水平上mitoG4 DNA的定量监测。

图1.Ir₂PDP作为磷光寿命探针鉴定和量化不同mitoG4 DNA的示意图。

Ir₂PDP的结构设计以经典G4 DNA稳定剂PhenDC3为母核进行理性修饰，通过铱(III)金属中心替换原结构中的1-甲基-喹啉阳离子单元。该结构改造策略在显著增大分子空间位阻、有效降低化合物对线粒体G4 DNA（mitoG4 DNA）的稳定活性的同时，保持了其线粒体靶向功能。表征结果证实，Ir₂PDP既不影响mitoG4 DNA的原位形成及固有稳定性，也无活性氧（ROS）生成效应，表现出优良的生物相容性与特异性线粒体靶向能力。选择性评估表明，Ir₂PDP对G4 DNA序列具有高度识别特异性，对生理环境中的pH波动、蛋白质、RNA、非G4构型DNA单链及双链DNA均无明显响应。在模拟生理高钾离子环境下，Ir₂PDP与75种不同序列mitoG4 DNA结合后，其磷光信号呈现显著增强效应，最大增幅可达113倍，体现出优异的信号放大能力与靶向结合活性。

图2.(a) Ir₂PDP、IrPhen和phenDC3结构图。(b)不同pH条件下Ir₂PDP荧光图。(c) Ir₂PDP对不同G4 DNA序列、非G4 DNA序列、双链DNA、RNA及蛋白质的磷光响应强度变化。(d)不同mitoG4 DNA序列滴定Ir₂PDP的磷光强度变化图。

Ir₂PDP具备优异的生物相容性与突出的光稳定性。细胞毒性评估结果显示，当Ir₂PDP浓度达到10倍工作浓度时，经48小时孵育后细胞存活率仍维持在90%以上，充分证实其低毒特性与良好的生物相容性。电子顺磁共振（EPR）表征结果表明，在实验设定的光照条件下，Ir₂PDP未诱导任何氧化活性物种的生成，进一步验证其在生物体系中应用的生物安全性。光漂白抗性实验数据显示，Ir₂PDP的光稳定性显著优于商用线粒体靶向染料MitoTracker Deep Red。基于上述优良特性，Ir₂PDP为线粒体G4 DNA（mitoG4 DNA）的长时间动态跟踪监测提供了可靠的工具支撑，展现出广阔的生物医学应用前景。

图3. (a) Ir₂PDP和IrPhen在不同浓度下的48小时细胞存活曲线。(b) (c) 光照/黑暗条件下Ir₂PDP的EPR检测结果。(d) (e) Ir₂PDP抗光漂白检测。

得益于Ir₂PDP对线粒体mitoG4 DNA的高特异性识别能力，激光共聚焦成像结果显示，该探针在细胞内呈现特征性点状信号分布，且信号与线粒体定位区域精准重合，与线粒体DNA（mtDNA）的天然分布模式高度一致。电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）定量分析结果进一步证实，Ir₂PDP在细胞线粒体内存在显著的靶向富集效应，为其mitoG4 DNA靶向性提供了直接的定量依据。为系统验证Ir₂PDP在生物体系中的靶向特异性，首先通过酶解实验进行底物类型筛选：采用DNA酶对细胞内DNA进行选择性降解后，Ir₂PDP的特征磷光信号几乎完全湮灭；而经RNA酶处理后，探针磷光强度未发生统计学差异，明确证实Ir₂PDP的靶向结合底物为DNA而非RNA。为进一步锁定其特异性结合靶点为mitoG4 DNA，分别采用特异性干预策略进行验证：经mitoG4 DNA稳定剂mitoPDS处理后，细胞内mitoG4 DNA的形成及稳定性显著提升，Ir₂PDP的磷光发射强度呈显著性增强；而经G4 DNA结构破坏剂二甲基硫酸盐（DMS）处理后，mitoG4 DNA结构被破坏，Ir₂PDP的特征信号几乎完全猝灭，从正反两方面证实了Ir₂PDP对mitoG4 DNA的特异性识别与结合能力。此外，激光共聚焦显微镜双光子成像表征结果显示，Ir₂PDP具有优异的双光子激发特性，其双光子吸收截面积与成像信噪比均满足生物样本成像需求，为深层组织及活体水平mitoG4 DNA的高精度成像分析奠定了技术基础。

图4. (a) Ir₂PDP线粒体靶向检测结果。(2)DNA酶和RNA酶消化细胞后，Ir₂PDP共聚焦成像检测结果。(c) mitoPDS和DMS预孵育细胞后，Ir₂PDP共聚焦成像检测结果。(d)单双光子成像示意图。(e)单光子（405 nm）和双光子(800 nm)激光共聚焦成像结果。(f)单光子（405 nm）和双光子(800 nm)激发下，Ir₂PDP组织3D细胞球穿透深度模拟检测。

尽管Ir₂PDP已展现出可靠的mitoG4 DNA成像性能，但单一磷光强度信号的变化难以实现不同序列mitoG4 DNA的有效区分。考虑到不同序列mitoG4 DNA的空间构象存在固有差异，Ir₂PDP与各类序列的结合作用强度亦呈现相应区别，而这种结合差异可进一步转化为磷光寿命的特征性变化。磷光寿命检测结果表明，Ir₂PDP与选取的8种mitoG4 DNA序列结合后，均表现出可明确区分的磷光寿命特征，为活细胞水平下通过磷光寿命成像技术实现不同序列mitoG4 DNA的特异性识别提供了实验基础。

图5. Ir₂PDP与不同mitoG4 DNA序列结合后的磷光寿命变化检测。(a)磷光寿命衰减曲线。(b) 磷光寿命统计结果。(c) Ir₂PDP通过磷光寿命区分不同mitoG4 DNA序列示意图。

基于分子水平上Ir₂PDP与不同序列mitoG4 DNA结合后呈现的显著磷光寿命差异，本研究以Ir₂PDP为mitoG4 DNA靶向探针，建立了双光子磷光寿命检测技术与相量分析联用的检测体系。通过相量分析策略实现不同序列mitoG4 DNA特异性信号的精准剥离与积分，最终在 HeLa 细胞及斑马鱼模型中，成功完成了8种mitoG4 DNA结构的空间分布可视化检测与定量分析。

图6.(a)Ir₂PDP区分不同mitoG4 DNA序列的示意图。(b)细胞水平磷光寿命成像和不同序列分布情况。(c)活体水平磷光寿命成像和不同序列分布情况。(d)细胞水平量化不同序列丰度。(e)活体水平量化不同序列丰度。

这一成果近期发表在J. Am. Chem. SOC. 上，中山大学博士后（现广东工业大学副教授）熊凯和中山大学附属第七医院助理研究员欧阳乘为论文共同第一作者，中山大学巢晖/陈禹教授和澳门大学梁重恆教授为论文共同通讯作者。上述该研究得到了国家自然科学基金（22120102002, 92353301, 22477148, and 22207134）、广东省自然科学基金（2021B1515020102、2023A1515012426）和湖南省科技创新计划（2021RC5028）等项目大力支持。

论文信息：Kai Xiong,^⊥ Cheng Ouyang,^⊥ Fa Wang, Ya Wen, Xianbo Wu, Jinzhe Liang, Yu Chen,* Chung-Hang Leung,* and Hui Chao*Facilitating Quantitation of Mitochondrial G‑Quadruplex DNA withan Iridium(III) Two-Photon Phosphorescence Lifetime ImagingProbe.//doi.org/10.1021/jacs.5c17409

全文链接：//pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.5c17409